多肽固相合成中常用顯色劑的配制和使用方法
在多肽固相合成中，我們通常使用一些顯色試劑對(duì)肽樹脂進(jìn)行檢測(cè)，來保證能夠快速定性檢測(cè)氨基酸是否偶聯(lián)完全、Fmoc保護(hù)基團(tuán)是否脫除成功。由于具有顯色反應(yīng)迅速，顯色明顯，檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，茚三酮顯為最常用的顯色試劑。溴酚藍(lán)，四氯苯醌等也是比較常用的顯色試劑，下面看一下各種顯色試劑的配制，使用方法以及注意事項(xiàng)。
1. 茚三酮顯色試劑
該顯色劑可以清楚地顯示游離胺的存在，由Kaiser等人開發(fā)因此也叫做Kaiser檢測(cè)。茚三酮顯色測(cè)試通常在氨基酸偶聯(lián)過程之前和之后進(jìn)行，目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)試劑。
1.1 配制方法
試劑A: 80g苯酚溶于20ml乙醇，為方便配制，苯酚可以提前加熱融化后配制。
試劑B: 2ml的0.001M的KCN水溶液加入98ml重蒸后的吡啶中。重蒸吡啶過程中可以加入少量茚三酮以除去吡啶中能使茚三酮變色的物質(zhì)。
試劑C：5g茚三酮溶于95ml乙醇中。
1.2 檢測(cè)方法
在杜氏玻璃小管中加入少量樹脂，一般使用鋪滿試管底部一層的樹脂，之后加入上述配制好的A、B、C三種試劑各兩滴，在100-120℃下加熱3-5min。如果樹脂顯藍(lán)色說明存在未保護(hù)的氨基，脫Fmoc完成。如果樹脂無色說明偶聯(lián)反應(yīng)完全。
1.3 使用說明
Kaiser測(cè)試雖然是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法，但他也有自己的局限性，例如不能檢測(cè)二級(jí)胺（如脯氨酸），也不能檢測(cè)無α-H的氨基酸的氨基（如二氨基異丁酸，α-甲基亮氨酸等α-雙取代氨基酸）。
茚三酮首先脫水與氨基縮合得到亞胺，隨后亞胺脫羧后異構(gòu)化為另一種形式的亞胺，水解后釋放出出一分子伯胺和一分子醛。伯胺進(jìn)一步與茚三酮發(fā)生縮合得到二聚的亞胺衍生物從而顯色。
2. 四氯苯醌顯色試劑
四氯苯醌顯色試劑主要用來檢測(cè)二級(jí)胺（如脯氨酸），也是一種比較常用的顯色試劑。由于脫Fmoc試劑一般都是二級(jí)胺（如哌啶，嗎啉，二甲胺），因此也可以用四氯苯醌顯色試劑來檢測(cè)肽樹脂從而判斷使用二級(jí)胺脫Fmoc后殘留的二級(jí)胺是否被洗滌干凈。
2.1 配制方法
試劑A: 2g四氯苯醌溶于98ml DMF中
試劑B: 2ml乙醛溶于98ml DMF中
2.2 檢測(cè)方法
在杜氏玻璃小管中加入少量樹脂，一般使用鋪滿試管底部一層的樹脂，之后加入上述配制好的A、B兩種試劑各兩滴，室溫下放置5-10min，若存在未保護(hù)的氨基一般樹脂顯藍(lán)綠色。
3. 溴酚藍(lán)顯色試劑
顯色快速而敏感，但由于顯色過于敏感，偶聯(lián)結(jié)束后顯色常常顯示偽陽性。
3.1 配制方法
1g溴酚藍(lán)溶于99ml DMA中。
3.2 檢測(cè)方法
在杜氏玻璃小管中加入少量樹脂，一般使用鋪滿試管底部一層的樹脂，之后加入上述配制好的溴酚藍(lán)溶液，立即顯色。如果樹脂顯藍(lán)色說明存在未保護(hù)的氨基。
4. TNBS顯色試劑
TNBS是2,4,6-三硝基苯磺酸
4.1 配制方法
試劑A: 5ml DIPEA溶于95ml DMF中
試劑B: 1g TNBS 溶于99ml水中
4.2 檢測(cè)方法
在杜氏玻璃小管中加入少量樹脂，一般使用鋪滿試管底部一層的樹脂，之后加入上述配制好的A、B兩種試劑各兩滴，室溫下放置10min，如果樹脂顯黃色或紅色說明存在未保護(hù)的氨基。